高效毛细管电泳法

毛细管电泳的特点

　　柱效高，可达105～106/m

　　分离速度快，几十秒～几十分钟

　　溶剂和试样消耗极少

　　没有高压泵，仪器成本比HPLC更低

　　选择性强

毛细管电泳的发展

　　1807～1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象。

　　1907年，Field和Teague首次用电泳成功分离了白喉毒素和它的抗体。

　　1937年，瑞典科学家将人血清提取的蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端加电压，第一次分离出白蛋白和a、b、g-球蛋白。 Tiselius还制成了第一台电泳仪并进行了第一次自由溶液电泳。他因对电泳技术的发展和应用的巨大贡献而获得1948年诺贝尔化学奖。自由溶液电泳的分离效率受焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行操作，使分析时间和分离效率很低。

　　1967年，Hjerten最早提出了用小内径管在高电场下进行自由溶液的电泳。

　　1981年，Jorgenson和Luckas发表了划时代的研究工作，用75um内径石英毛细管进行电泳，电迁移进样，荧光柱上检测丹酰化氨基酸，达到400000块/m理论塔板数的高效率。从此跨入高效毛细管电泳的时代。

　　1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。

　　1987年Hjerten建立了毛细管等电聚焦,Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。

　　1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。

毛细管电泳法和其他分析方法的区别

　　毛细管电泳法和高效液相法的区别

　　CE和高效液相色谱法(HPLC)相比,其相同处在于都是高效分离技术,仪器操作均可自动化,且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间,CE的分析时间通常不超过30min,比HPLC速度快；对CE而言,从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比,对扩散系数小的生物大分子而言,其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级,最低可达270fl,流动相用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为μl级,流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备,而HPLC可作常量制备。

　　毛细管电泳法和普通电泳法的区别

　　CE和普通电泳相比,由于其采用高电场,因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外,其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之,CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度,常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率,其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万,而HPLC一般为几千到几万；高速度,最快可在60s内完成,在250s内分离10种蛋白质,1.7min分离19种阳离子,3min内分离30种阴离子；样品少,只需nl(10-9L)级的进样量；成本低,只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力,使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术,有些理论研究和实际应用正在进行与开发。

毛细管电泳的分类

　　按填充物质的性状

　　自由溶液电泳和非自由溶液电泳。

　　按分离机制分类

　　电泳型、色谱型、电泳/色谱型

　　主要分离模式

　　毛细管区带电泳

　　胶束电动毛细管电泳

　　微乳液电动毛细管色谱

　　毛细管凝胶电泳

　　毛细管等电聚焦

　　毛细管电色谱

　　非水毛细管电泳

毛细管电泳理论

　　电泳和电泳淌度

　　电泳：在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动

　　电渗和电渗率

　　电渗：液体相对于带电的管壁移动的现象

　　CE所用的石英毛细管柱,在pH>3情况下,其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和,正离子的运动方向和电渗流一致,故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度一般都大于电泳流速度,故它将在中性粒子之后流出,从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。

　　电渗是CE中推动流体前进的驱动力,它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动,使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型,其中心处速度是平均速度的两倍,导致溶质区带本身扩张,引起柱效下降,使其分离效率不如CE。

　　表观淌度和权均淌度

　　分离效率和谱带展宽

　　（一）理论塔板和塔板高度

　　同色谱

　　（二）谱带展宽

　　1. 流型

　　毛细管电泳——扁平型塞子流（高柱效）

　　高效液相——抛物线型

　　2. 自热

　　电流通过缓冲溶液时产生的焦耳热

　　自热导致径向温度梯度，因而产生离子迁移速度的径向不均匀分布，使谱带展宽

　　管内径小，管外径大，可减小自热引起的温度差

　　如：内径50um，外径375um

　　EdC1/3<1500时，自热不会引起太大的谱带展宽和效率损失

　　3. 扩散与吸附

　　扩散：在毛细管电泳中，溶质纵向扩散是谱带展宽的唯一因素

　　吸附：毛细管管壁对于被分离物质粒子的作用

　　阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用

　　疏水作用

　　毛细管内表面积和体积比越大，吸附的可能性也越大

　　分离度

毛细管电泳的主要分离模式

　　毛细管区带电泳CZE

　　1. 操作电压

　　柱长一定时，操作电压增加，粒子迁移加快，柱内焦耳热增加

　　在一定范围内柱效随电压的升高而升高，过了极点后，焦耳热影响加剧，反而下降 n= ? spELd/2D

　　2. 缓冲溶液的种类

　　直接影响粒子的迁移和分离

　　要求：缓冲容量好、在检测波长处吸收低、自身淌度低、与等电点相差约1个pH单位、尽量用酸性

　　3. 缓冲溶液的pH

　　影响溶质的电荷：pH低于溶质的等电点时，溶质带正电荷；反之，带负电荷

　　引起电渗的变化：在高pH下，电渗很大

　　4. 缓冲溶液的浓度

　　浓度增加，离子强度增加，改善分离

　　浓度增加，电渗率降低，迁移时间延长

　　浓度增加，导电的离子数增加，焦耳热增加

　　胶束电动毛细管色谱MECC

　　以胶束为假固定相的一种电动色谱

　　在电泳缓冲溶液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂中的疏水基团可形成胶束，溶质因淌度和分配系数的不同而分离。

　　1. 胶束假固定相

　　表面活性剂：亲水基+疏水基

　　疏水基：直链或支链烷烃

　　亲水基：阳离子、阴离子、两性离子基团

　　2.基本原理

　　增加了带电离子胶束相，其具有与周围介质不同的淌度，并且可以与溶质互相作用

　　导电的水溶液相是分离载体的溶剂

　　3.流动相

　　改变流动相来调节选择性

　　毛细管凝胶电泳CGE

　　将平板电泳中的凝胶用到毛细管中作支持物进行电泳，不同体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中得以分离。

　　常用凝胶：聚丙烯酰胺、葡聚糖、琼脂糖等

　　应用：蛋白质、核苷酸、RNA、DNA片段分离和测序、聚合酶链反应产物分析等等

　　毛细管电色谱CEC

　　将高效液相色谱中众多的固定相微粒填充到毛细管（或涂渍、键合到管壁），以样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程称为毛细管电色谱。

　　具有高效液相色谱的高选择性

　　具有毛细管电泳的的高效性

　　毛细管柱类型：填充柱、开管柱

　　非水毛细管电泳NACE

　　非水（有机溶剂）体系中进行的毛细管电泳

　　在有机溶剂中加入电解质使之具有一定的导电性才能实现NACE，酸及其铵盐是最常用的电解质

　　与水体系相比可承受更强的电场，在不增大焦耳热的条件下可提高溶液中离子的浓度或增大毛细管内径

毛细管电泳的仪器组成

　　基本结构：高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管、温度控制、检测、记录/处理

　　高压电源

　　电源：0～?30 kV直流高压电源

　　电极：铂丝或注射器针头

　　电极槽：带螺帽的小玻璃瓶或塑料瓶（1～5ml）

　　毛细管柱

　　化学惰性、电惰性，可以透光

　　聚四氟乙烯、玻璃、石英

　　内径25～75um，管长<70cm

　　冲洗和平衡

　　进样

　　毛细管直接与样品接触，用动力驱动样品进入毛细管，无死体积

　　1. 电动进样

　　组分在电场作用下，因电迁移和电渗作用进入毛细管内

　　对离子组分存在进样偏向

　　2. 压力进样

　　将毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入

　　无组分偏向，选择性差

　　3. 扩散进样

　　利用浓差扩散，抑制背景干扰和进样偏向

　　检测

　　1. 紫外检测

　　2. 激光诱导荧光检测